The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in programmed cell death of Cajal-Retzius cells and their contribution in the maturation of functional and dysfunctional cortical circuits - Université Paris Cité Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in programmed cell death of Cajal-Retzius cells and their contribution in the maturation of functional and dysfunctional cortical circuits

Le role de la voie PIK3/AKT/mTOR dans la mort programmée des cellules de Cajal-Retzius et leur contribution dans la maturation des circuits corticaux fonctionnels et dysfonctionnels

Résumé

Cajal-Retzius (CR) cells are a class of transient excitatory neurons, generated from different domains located at the edges of the pallium in the embryonic telencephalon, the pallial septum (SE), the pallial-subpallial boundary (PSB), the cortical hem (CH), and the thalamic eminence (ET). SE-CRs, CH and ET contribute to approximately 80% of the total population of CRs in the neocortex, which commonly expresses the DeltaNP73 gene. From these sources, they migrate tangentially to cover the entire surface of the developing cortex. CRs play a key regulatory role in several stages of cortical development such as controlling neuronal migration, layer formation, and cortical areas patterning in the developing telencephalon via the secretion of several proteins such as extracellular matrix glycoprotein Reelin. After fulfilling their roles, CRs largely disappear during the first two postnatal weeks in mice by programmed cell death. Persistence of CRs during postnatal life has been detected in several pathological conditions related to epilepsy. Still, it is not yet clear whether their persistence is a cause or a consequence of these diseases. In order to study their contribution to these diseases, it is essential to decipher the possible molecular mechanisms involved in their death. The PI3K/AKT/mTOR pathway is well known to play an important role in several cellular functions related to cell proliferation, growth, metabolism as well as PCD modulation by regulating apoptosis and autophagy. In addition, dysregulation of this pathway has been shown to be one of the main causes of malformations of the cortex during development (MCD) and responsible for epileptic seizures. Considering the critical role of this pathway in cell survival, the main objective of this PhD project is to explore the role of this pathway in the modulation of PCD in the CRs. We first focused on the physiological activity of this pathway in CRs derived from DeltaNP73 positive progenitors at two stages: embryonic day 17.5 (E17.5) and post-natal day 1 (P1) before the cell death occurred. We have shown that this pathway is less active in 1 CRs after birth. In parallel, we separately explored the spatio-temporal activity of the AKT and mTOR pathways, which revealed the presence of a spatial difference in the activity of the two pathways in the rostro-caudal and medio-lateral axes. Then, using targeted genetic approaches involving positive (PIK3CA) or negative (PTEN or TSC1) regulators of the pathway, we demonstrated that maintaining its activity leads to a significant survival of CRs at a post-natal stage, with a stronger effect in PTEN. This survival is accompanied by a significant increase in the expression and secretion of Reelin by persistent CRs. A more focused analysis of the PTEN mutant showed that the morphology of persistent cells in the brain of these animals is modified leading to alterations in their intrinsic electrophysiological properties and their responses to injected currents. However, the cortex of mutated animals for PTEN does not show major alterations in the layers of pyramidal neurons but an increase in the activation of their mTOR pathway activity. Behavioral analyzes of locomotor activity, anxiety or working memory do not show any differences compared with controls. Similarly, increased mTOR signaling in the cortex is not associated with hypersensitivity to the development of seizures induced by kainate injection. Altogether, I showed that the reduction in the activation of the PI3K/AKT/mTOR pathway in CRs primes these cells to cell death probably through inhibiting an anti-apoptotic mechanism, and that the mTOR branch of the pathway contributes less to this survival.
Les cellules Cajal-Retzius (CRs) appartiennent à une classe particuliére de neurones excitateurs transitoires, générés à partir de différents domaines situés aux bords du pallium dans le télencéphale des jours embryonnaires (E) 9,5 à E12.5 : le septum pallial (SE), la frontière palliale-sous-palliale (PSB), l'heme cortical (CH) et l'éminence thalamique (ET). À partir de ces sources, elles migrent tangentiellement pour couvrir toute la surface du cortex au cours de son développement. Environ 80 % de la population totale de CR dans le néocortex, exprimant le facteur de transcription DeltaNP73, est issu des régions SE, CH et ET. Les CRs jouent un rôle de régulateur clé dans plusieurs étapes du développement cortical via la sécrétion de plusieurs protéines dont la glycoprotéine de la matrice extracellulaire Reelin : le contrôle de la migration des neurones, la formation de couches et la structuration des zones corticales dans le télencéphale en développement. Bien qu'elles aient une forme similaire, les sous-populations de CR diffèrent les unes des autres de plusieurs manières, notamment par leur signature moléculaire, leur propension à coloniser des régions particulières du cortex en croissance et la dynamique de leur disparition, qui varient à la fois dans l'espace et dans le temps. Des études de traçage génétique chez la souris ont montré que les CRs ne disparaissent pas par migration, transformation ou dilution dans un cortex en croissance mais par mort cellulaire programmée (MCP) très probablement par apoptose dans les premières semaines après la naissance. Certains états pathologiques liés à l'épilepsie ont été associés à une persistance des CRs dans le cortex et dans l’héme. Bien que les études citées suggèrent un lien entre la malformation des développements corticaux associés à l'épilepsie et la survie de la CR, il n'est pas clair si cette persistance anormale est la cause ou simplement la conséquence des différentes maladies. Cependant, la maturation adéquate des circuits corticaux pourrait être affectée par la persistance des CR. Afin de répondre à cette question, mon laboratoire s'est concentré sur l'identification et la régulation du mécanisme potentiel de mort cellulaire des CR, ainsi que sur l'étude des conséquences de leur persistance. Une étude récente de notre laboratoire sur l'inactivation conditionnelle de Bax, l'une des protéines pro-apoptotiques impliquées dans la voie mitochondriale intrinsèque, a démontré que les sous-types de CR meurent selon plusieurs mécanismes de mort cellulaire, ceux du SE partiellement par apoptose et ceux de l’hème par une autre voie. Ce résultat est en accord avec la littérature récente, démontrant l'existence de nombreux mécanismes de mort cellulaire, déclenchés par des signaux à la fois intrinsèques et extrinsèques, qui par une interaction complexe collaborent entre eux pour provoquer la mort d'un neurone. Pour cette raison, déterminer le mécanisme précis par lequel une population cellulaire particulière meurt est rendu difficile. Cela nous a incité à aborder le sujet d'un autre point de vue : au lieu d'étudier de nombreux mécanismes de mort cellulaire, qui peuvent éventuellement se compenser, nous nous sommes concentrés sur la recherche de signaux qui protègent les CR de la mort jusqu'aux premières semaines après la naissance. Il a été démontré que l'élimination complète du facteur de transcription deltaNp73 en utilisant des mutants deltaNp73cre/cre, provoque la mort précoce des CR à E12.5. Par conséquent, deltaNp73 est essentiel pour la survie de CH et SH-CR jusqu'à P0, lorsque son expression commence à diminuer. Ce facteur de transcription protège probablement les CR tout au long du développement, mais sa baisse d’expression après la naissance rend ces neurones plus sensibles aux signaux nocifs, qu'ils soient intrinsèques ou externes. Il a été démontré que deltaNp73 et peut antagoniser l'activité de p73, un facteur de transcription impliqué dans l'initiation de la mort cellulaire. En effet, deltaNp73 et p73 entrent en compétition pour la régulation génique de diverses cibles dont PTEN, un gène suppresseurs de tumeurs dont la protéine régule la voie PI3K/AKT. Il a été démontré que l'élimination des facteurs neurotrophiques, qui sont essentiels à la survie des neurones, provoque l'apoptose. Il a été établi que les molécules de signalisation du facteur de croissance PI3K et la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) sont nécessaires à la survie neuronale. Des preuves récentes indiquent qu'Akt, l'une des cibles en aval de PI3K, est la principale cause de ces défenses contre diverses voies de mort cellulaire. De plus, il a été déterminé que la dérégulation de ce système est la cause sous-jacente d'un certain nombre de troubles neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques. Au cours de ma thèse je me suis concentré sur les mécanismes de la mort cellulaire programmée (MCP) de la population de CRs dérivés des regions SE, CH et ET et en particulier sur le rôle de la voie PI3K/AKT/mTOR dans la survie des CRs. J’ai tout d'abord étudié l'activité spatio-temporelle de cette voie de manière à couvrir toutes les sous-population de CRs ainsi que leur chronologie de mort. Pour cela nous avons profité du traçage génétique permanent en utilisant des lignées deltaNp73Cre/+> R26mT/+ à deux stades : E17.5 et P1, avant la mort cellulaire donc le pic est entre P4 et P10. J’ai étudié par immunofluorescence sur des coupes de cerveau la phosphorylation de deux protéines AKT et S6 de la voie de signalisation. L'analyse spatiale de la voie PI3K/AKT/mTOR dans l'axe médio-latéral des CR a confirmé que cette voie ne se comporte pas de manière linéaire. Les CR situés dans la partie médiale du cortex montrent plus d'activation de la voie PI3K/AKT alors que les CR latéraux ont plus d'activation de la voie mTOR. Cela suggère que la position de la cellule dans le cortex peut affecter ses propriétés moléculaires. De plus, l'étude temporelle de cette voie comme l'un des signaux de survie potentiels dans les CR a révélé que l'activité globale de cette voie diminue significativement après la naissance et à P1, soit à peu près au même moment où l'expression de l’isoforme deltaNp73 (P0) commence à diminuer. Ensuite, nous avons étudié si le maintien de l'activité de la voie PI3K/Akt/mTOR module la MCP dans les CRs. Trois modèles de souris conditionnelles ont été générés par des approches génétiques pour cibler l’activation de la voie dans les CRs dérivés de deltaNp73 : le premier permet l’activation de la kinase PI3K (R26p110*) et les 2 autres inactivent des régulateurs négatifs (PTEN et TSC1). Cibler différents membres de la voie PI3K/AKT/mTOR nous a donné l'avantage de disséquer l’implication des différents mécanismes (apoptose, autophagie…) dans la MCP des CRs. De plus, PTEN possède des fonctions indépendantes de son activité phosphatase du PIP3 et la comparaison des modèles PIK3 et PTEN nous a permis d’ inhiber le(s) mécanisme(s) connu(s) et inconnu(s) probablement impliqué(s) dans la MCP de CR. Dans les trois modèles, deltaNp73Cre/+> R26mT/+;Ptenlox/lox , deltaNp73Cre/+> R26mT/+;Tsc1-/lox et deltaNp73Cre/+> R26p110*lox/mT, le développement du cortex et des CRs ne sont pas altérés, suggérant que la suractivation de cette voie dans les CR n'interfère pas avec le bon développement du cortex. Dans l'ensemble, nous avons observé la persistance de CRs dans tous les modèles après P10, ce qui suggère le rôle critique de cette voie dans la survie des CRs. Fait intéressant, la proportion de cellules persistantes était différente dans chaque modèle, soulignant le rôle distinct de chacune de ces molécules dans la survie cellulaire malgré leur étroite collaboration. La différence observée peut être expliquée par l’implication possible de divers facteurs en aval de chaque molécule. En activant PI3K, nous avons principalement ciblé l'activation d'Akt en tant que facteur anti-apoptotique interférant avec les voies de la mort cellulaire en phosphorylant les principales protéines régulatrices de l'apoptose et en déplaçant le rapport des protéines pro- et anti-apoptotique vers l'inhibition de la mort cellulaire. Cependant, l'inactivation conditionnelle de PTEN a entraîné un nombre plus élevé de CR persistants dans le néocortex par rapport à PIK3CA. Cela peut s'expliquer par le rôle de PTEN dans le contrôle de la mort cellulaire indépendamment de la voie PI3K. Outre la différence dans le nombre de CR observés dans le modèle PTEN, la morphologie des cellules a été radicalement modifiée, les cellules grossissent considérablement avec davantage de branches dendritiques et, dans certains cas, elles ont complètement changé leur morphologie bipolaire en un neurone dysmorphique. Cela peut être associé à l'interaction de PTEN avec les protéines structurelles, accessoires ou régulatrices du cytosquelette d'actine bien que les effets directs ne soient pas encore connus. Il a été démontré que la voie mTOR (en aval de l'AKT) est impliquée dans le contrôle de la mort cellulaire autophagique. Pour tester si l'autophagie contribue à la mort cellulaire des CR, nous avons ciblé l'activation de mTORC1 via la suppression de TSC1. Malgré l'augmentation du nombre de CR dans les parties intermédiaires et caudale du cerveau, le phénotype est moindre que dans les modèles PTEN ou PIK3CA suggérant que l'activation de la voie mTOR ne contribue pas beaucoup à la persistance des CR. De plus, les CR exprimaient des quantités significativement plus élevées de reelin aux stades P1 et P24 avec le suivi de l'expression de la reelin dans la matrice extracellulaire à P1. Pour étudier les conséquences de la persistance des CR dans la maturation des circuits corticaux et également tester l'hypothèse selon laquelle la persistance des CR est responsable de certaines affections neurologiques mentionnées ci-dessus, nous avons mené diverses expériences, principalement axées sur les mutants PTEN. L’enregistrement par patch-clamp des CR a révélé des altérations de leurs propriétés électrophysiologiques intrinsèques et de leurs réponses aux courants injectés. Cependant, le cortex des animaux mutés pour PTEN ne montre pas d'altération majeure dans les couches de neurones pyramidaux mais une augmentation de l'activité de la voie mTOR plus probablement due à une augmentation de la sécrétion de la reelin par les CRs. Les analyses comportementales de l'activité locomotrice, de l'anxiété ou de la mémoire de travail n'ont montré aucune différence par rapport aux témoins. De manière surprenante, l'augmentation de la signalisation mTOR dans le cortex n'a pas entraîné d'hypersensibilité au développement de crises induites par l'injection de kaïnate, un résultat négatif confirmé par les enregistrements multiélectrodes (MEA) du potentiel de champ des neurones dans le cortex somatosensoriel S1. Au total, le résultat de ce projet de thèse a montré que la réduction de l'activité de la voie PI3K/AKT/mTOR dans les CRs sensibilise ces cellules à la mort cellulaire probablement en inhibant un mécanisme anti-apoptotique et que la branche mTOR de cette voie contribue peu à cette survie. De plus, nous avons montré que la persistance des CR par l'inactivation de PTEN n'augmente pas la susceptibilité à développer des crises plus probablement en raison d'une augmentation de l'expression de la reelin dans le système, comme récemment montré dans plusieurs études dans lesquelles l'augmentation de la reelin dans le système prévient l’apparition de certains phénotypes comportementaux liés à la schizophrénie, au trouble bipolaire et même à l'épilepsie.
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Dates et versions

tel-04033046 , version 1 (16-03-2023)

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  • HAL Id : tel-04033046 , version 1

Citer

Nasim Ramezanidoraki. The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in programmed cell death of Cajal-Retzius cells and their contribution in the maturation of functional and dysfunctional cortical circuits. Life Sciences [q-bio]. Universite Paris Cité, 2022. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-04033046⟩

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